| 產品索引 | 5872 |
| 中文名稱： | PCR產物及凝膠回收試劑盒 |
| 英文名稱： | MagExtractor®-PCR & Gel Clean up- |
| 產品編號： | NPK - 600 |
| 產品類別： | 分子生物學 |
| 生產廠家： | TOYOBO |
| 產品價格： | 300元 |
| 產品規格： | 50次 |
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用說明書
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
—目錄—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 純化流程...................................................................................... 2
[3] 試劑盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收瓊脂糖凝膠........................................................................... 5
[7] 疑難解答...................................................................................... 8
注意：
本試劑盒中所包含的都是研究用試劑。請不要用于診斷，臨床等場合。在使用本試劑盒的時候，請嚴格遵守實驗室的基本注意事項，注意安全。由于本試劑盒內含有對人體有害的試劑，所以請務必嚴格遵守各試劑的相關使用說明書，按要求使用保護罩等防護措施。
[1] 前言
MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic（鹽）試劑存在的情況下，核酸能吸附在硅膠上的特性1），用于手動對DNA片段進行純化。本試劑盒采用磁硅膠粒子，若使用磁性臺架，則能最大限度地減少復雜的離心操作，能夠快速地的純化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
| ·從DNA溶液（約100μl），以及TAE·TBE瓊脂糖凝膠（約0.3g）中， 能夠以平均回收率60～70％比例回收DNA片段（約100bp～50kbp）。 ·能夠在5分鐘之內從DNA溶液中，或者在15分鐘之內從瓊脂糖凝膠 中回收DNA片段。 ·由于在室溫下瓊脂糖凝膠可以被融解，因此無需進行加熱反應。
* 要徹底去除混雜在回收液中的乙醇時則需要進行加熱處理（55℃）。 |
試劑盒的用途
| ·脫鹽，去除dNTPs。 ·去除引物。 ·去除酶（堿性磷酸酶等）。 ·從電泳后的瓊脂糖凝膠塊中回收DNA。 |
回收的DNA的用途
| ·RI.Non-RI測序反應 ·限制酶反應 ·標記反應 ·雜交反應 ·連接反應 ·轉化反應 ·擴增反應 |
[2] 純化流程
下圖顯示為使用MagExtractor-PCR &
Gel Clean up-時的純化流程。
|
純化DNA片段
|
|
Elute
|
|
75％乙醇
|
|
洗凈液
|
|
溶出液
|
|
磁石 磁性或離心分離
|
|
磁珠
|
|
Wash
|
|
Bind
|
|
Melt
|
|
凝膠塊
|
|
吸附液
|
|
電泳后的凝膠
|
[3] 試劑盒中所包含的物品
本試劑盒中包含以下試劑。（200次份）
|
| 試劑量 | 保存條件 |
| 吸附液* | 88ml | 避光室溫保存 |
| 洗凈液* | 132ml | 室溫保存 |
| 磁珠 | 7ml | 室溫保存 |
*吸附液，洗凈液在低溫情況下會析出結晶。請一邊用手捂暖，一邊
將其倒轉混合讓結晶溶解后使用。另外，吸附液及洗凈液內含有蛋白
變性劑。在使用時務必注意，萬一沾到身體，請立刻用清水沖洗。
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品
1．試劑
·滅菌蒸餾水<溶出液>
·75％乙醇<洗凈用>
2．器具，器材
·1.5ml小型試管用磁性臺架
·簡易臺式離心機
·漩渦混合器
·Heat Block 55℃（用于在需要去除混于回收液中的乙醇的場合）
*可使用本公司的磁性臺架Magical Trapper（Code No.：MGS-101）等產品。
[5] 回收DNA溶液
1．前言
·本操作程序用于從DNA溶液（約100μl）中回收DNA片段。
·能夠回收的DNA大小約為100bp～50kb。另外，40bp以下的核酸
幾乎能夠被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量為每30μl磁珠大約吸附5μg。使用時請以2.5μg左右為參考量。
·能夠從PCR反應液，限制酶反應溶液，堿性磷酸酶反應液等各種反
應液中回收DNA。
·回收后的DNA，能夠用于限制酶處理、測序、連接、標記、雜交等多種反應
2．操作程序
DNA溶液（100μl）1）
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不時用漩渦混合器攪拌，并放置約1～2min（室溫）
B/F（固/液）分離3）
↓←（600μl洗凈液）4）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。3）
↓←1ml75％乙醇4）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。3）
瞬時高速離心，徹底去除上清部分。
（打開小型試管的蓋子，55℃下放置5min，干燥）4）
↓←25～100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec，
（在無法充分將粒子分離的情況下，請用pipetting來分離粒子。）
↓放置2min
B/F分離，回收上清液。5）
1）請盡量不要含礦物油。
2）使用磁珠前，請徹底懸濁混合后再使用。
3）將試管放置在磁性臺架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持續去除
上清部分。通過乙醇清洗時，可以通過將上清液倒入其他容器進行去除。
B/F分離時推薦使用對應于微型試管的磁性臺架，但也可用簡易臺式離心機，用大約6,000r.p.m程度，5sec.的離心進行分離。g會根據離心機的轉子口徑而發生變化，所以請調整旋轉數，使得能更有效地集合粒子，并保證凝結不至于過度。
4）請參照3.的表。
5）回收液中少量混入的磁珠并不會有礙下一次的反應，但在測定吸附度
等場合時，請通過瞬時高速離心除去磁珠。
3．關于工序的省略，純化規模
·洗凈工序，加熱工序可以省略（請參照下表）
| 用途 | 洗凈 | 干燥 | 備注 | |
| 洗凈液 | 75％乙醇溶液 | |||
| 測序，限制酶反應，連接反應等的前處理 | － | 1次 | － | 標準操作程序。回收的核酸能用于Low Buffer系列的限制酶切斷。 |
| 鹽的混入會產生影響的場合 | － | 2次 | － | 吸附液和洗凈液含有高濃度的鹽分。 |
| 乙醇的混入會產生影響的場合 | － | 1次（2次） | 55℃，5min | 用于易受乙醇影響的前處理。 |
| 要去除混入的酶的場合 | 1次 | 1次（2次） | － | 用于去除堿性磷酸酶等。 |
| 要通過吸光度來準確定量核酸濃度的場合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液內含有能吸收紫外線的物質。 |
·根據DNA溶液的量，可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時，無需減少75％乙醇溶液的使用量。
[6] 回收瓊脂糖凝膠
1．前言
·本操作程序適用于從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠（約0.3g）中回收
DNA片段。本操作程序是以瓊脂糖濃度2％以下的凝膠為對象。
要使用2％以上的凝膠時，推薦所使用凝膠的量少于0.3g。另外，本
操作程序不需要使用特殊的低融點瓊脂糖凝膠。
·能夠回收的DNA大小約為100bp～50kbp。
·回收后的DNA主要用于連接反應、標記、測序等反應。
2．操作程序
瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色。
↓
在UV照射下（Long wave），為了使得目標條帶盡可能地變小，使
用切割刀或手術刀等進行切開。
↓
把切開的瓊脂糖切細，放到1.5ml小型試管中。（此時稱得重量，如
果大于0.3g則分幾次進行。）1）
↓←400μl吸附液
在凝膠完全溶解之前，將其放置在室溫中，并不時進行攪拌。2）
↓←30μl磁珠3）
↓經常用漩渦混合器攪拌，并放置2min（室溫），
B/F分離。4）
↓←600μl洗凈液
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。4）
↓←1ml75％乙醇溶液5）
↓漩渦混合器攪拌10sec，
B/F分離。4）
瞬時高速離心，徹底去除上清部分。
（打開微型試管的蓋子，55℃下放置5min，干燥）5）
↓←25～100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec
（在無法充分分開粒子的情況下，請用pipetting來分散粒子。）
↓放置2min
B/F分離，回收上清液6）
1） 將瓊脂糖凝膠制成切片，以利于溶解。
2） 如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或凝膠難以溶解時，請加溫至55℃
5min。
3） 使用磁珠前，請徹底混合后再使用。
4） 將試管放置在磁性臺架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持續去
除上清部分。要洗凈乙醇，也可以通過將上清液倒入其他容器來去除。
B/F分離時推薦使用對應于微型試管的磁性臺架，但也可使用簡易臺式離心機，用大約6,000r.p.m程度，5sec.的離心進行分離。g會根據離心機的轉子口徑而發生變化，故請調整旋轉數，使得更有效地集合粒子，并保證凝結不至于過度。
5） 請參照3.的表。
6） 回收液中混入少量磁珠并不會有礙下一次的反應，但在測定吸附
度等場合時，請通過瞬時高速離心除去磁珠。
3．關于工序的省略，純化規模
·洗凈工序，加熱工序可以省略（請參照下表）
| 用途 | 洗凈 | 干燥 | 備注 | |
| 洗凈液* | 75％乙醇溶液 | |||
| 連接反應, 測序等 | 1次 | 1次 | － | 標準操作程序。 |
| 鹽的混入會產生影響的場合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液和洗凈液中含有高濃度的鹽分。 |
| 乙醇的混入會產生影響的場合 | 1次 | 1次（2次） | 55℃，5min | 用于容易受乙醇影響的前處理。 |
| 要通過吸光度來準確定量核酸濃度的場合 | 1次 | 2次 | － | 吸附液內含有吸收紫外線的物質。 |
*從瓊脂糖凝膠中回收核酸時，必須用洗凈液清洗。
·根據DNA溶液的量，可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時，無需減少75％乙醇溶液的使用量。
[7] 疑難解答
1．回收量低
| 原因 | 對策 |
| 去除乙醇不徹底 | 瞬時高速離心后，請仔細去除75％乙醇溶液。 |
| 溶出不充分 | 通過10mM Tris-HCI（pH8.0），或者TE buffer能夠提高溶出的效率。另外，如果加溫至55℃保持2min能夠更加有效地提高溶出效率。 |
| 吸附時間不合適 | 如果吸附過剩，回收量則會變少。最恰當的吸附時間是，對于DNA溶液為1～2min，對于凝膠則為2min。 |
| 溶出時的攪拌不充分 | 溶出時，如果磁珠的混合不充分，回收量會減少。在瞬時高速離心后，磁珠會在底部結塊，請仔細將其散開。特別是在從瓊脂糖凝膠中進行純化的時候，結塊的磁珠會比較難以重新散開。 |
| 瓊脂糖凝膠的量大于0.3g | 請減少瓊脂糖凝膠的量。 |
| 使用2％以上的瓊脂糖 | 請減少瓊脂糖凝膠的量。 |
| 沒有用洗凈液清洗 | 從瓊脂糖凝膠中回收DNA時，請務必先用洗凈液清洗。 |
2．回收的核酸的吸光度不準確
| 原因 | 對策 |
| 清洗不充分 | 吸附液中含有吸收紫外線的物質。要對回收的核酸定量，請用洗凈液以及75％乙醇溶液來清洗。 |
| 混入了吸附液 | 吸附液中含有吸收紫外線的物質。請仔細去除吸附液。用面紙等擦拭試管的蓋子上沾有的吸附液，可以有效改善狀況。 |
3．回收后的核酸不能良好地進行反應
| 原因 | 對策 |
| 鹽阻礙了反應 | 請添加兩次75％乙醇溶液進行清洗的工序。吸附液和洗凈液都含有高濃度的鹽分。 |
| 乙醇阻礙了反應 | 請按照操作程序，對乙醇進行干燥處理。 |
| 酶未能完全去除 | 要去除反應液中的堿性磷酸酶等酶，請用洗凈液以及75％乙醇溶液進行清洗。 |
| 反應用的酵素過少 | 從瓊脂糖凝膠中回收核酸時，反應用的酶量應比通常要多，這樣就能得到準確良好的結果。 |
| 使用的瓊脂糖級別不夠 | 請使用高級別的瓊脂糖。 |
| 從瓊脂糖凝膠中分離條帶時，受到的紫外線照射過多 | 請用Long wave（365nm附近）的紫外線來進行切片工作。 |
